尊龙凯时为您提供关于FAQ总RNA提取的详细解读，特别是针对酚CHCL3抽提法及相关注意事项。在RNA提取过程中，必须选用新鲜的组织或细胞样本。对于冷冻样本，需尽量避免反复冻融，以免导致RNA降解。样本一旦离开活体或原生环境，内源RNase便开始对RNA进行降解，降解速度与RNase浓度及环境温度密切相关。推荐将新鲜组织浸泡于RNAKeeperTissueStabilizer（Vazyme#R501）中，可以使组织在室温下保存一周，或在4℃下保存一个月，亦可在-20℃/-80℃下进行长期保存。

在提取过程中，若样品量过大，可能造成裂解不充分，进而导致RNA收率下降。此外，若RNA保存时间过长，亦会加速降解。建议对提取的RNA进行纯度及完整性检测，并将其分管至-80℃进行长期保存或在-20℃下短期保存，尽快使用，以避免反复冻融带来的损害。

在使用CHCL3进行抽提时，如果RNA被基因组污染，需在低温环境（2℃-8℃）下高速离心。离心后，RNA会被抽提至上层水相，而中下层则为有机相，含有CHCL3，DNA则位于中层。常温下CHCL3与水易互溶，可能导致水相中出现少量基因组DNA污染。因此，吸取上层液体时应谨慎，防止吸入中层和下层液体。

对于加入异丙醇后未见RNA沉淀的情况，可尝试在4℃或-20℃下放置10-30分钟后再次离心。如仍无沉淀，建议采取吸取而非倾倒的方式以避免沉淀损失。

总RNA提取的柱式提取法

在使用gDNA-FilterColumns时，出现堵塞的常见原因包括样品用量过多和样品中富含肌纤维（如来自肌肉、心脏及皮肤等组织）。因此，使用时应适量减少样品量，并考虑使用液氮研磨以缓解堵柱现象。此外，若组织研磨或均质不充分，片段可能导致柱堵塞，建议在裂解后进行离心以去除大颗粒。

低RNA产量或无法提取RNA的原因可能包括样本保存不当、未能充分进行匀浆、或洗脱不完全。建议采集新鲜样本，或用液氮快速冷冻后存放于-70℃。在洗脱过程，建议将RNase-free的ddH2O滴加至纯化柱膜中央，充分洗脱以提高RNA的回收效率。

RNA降解问题

RNA的降解主要与样本质量及操作过程有关。若样本未及时保存或经历多次冻融，RNA往往会降解。处理过程中，电泳设备及耗材需确保为RNase-free，以避免降解风险。

在下游实验中，如遇到不理想的结果，可能是由于洗脱后RNA中残留盐离子或乙醇。此时需进行适当的二次洗涤，并在离心后室温放置以去除残留物质。

对于逆转录反应，建议使用含有基因组去除模块的逆转录试剂，以提高实验的准确性。此外，根据模板特性选择适宜的引物，并确保反应条件的优化，以提高扩增效率。

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